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高通量测序的十年:从科研进入临床

时间:2019-07-02 05:58 来源:未知 作者:admin 阅读:

  高通量测序的推出配景:

  2004年全球多个国家共计预算30亿美金的人类基因组测序完成以后,发现单单完成一小我私家的基因组序列还远远不足以明白人类自身及疾病的机理。由于有了已经完成的人类基因组当做参考基因组,接纳廉价、快速的要领对多个样本、群体、病种基因组的比对测序就能提供大量有价值的科研和临床信息。这就要求测序价钱足够低、速率足够快,然而对测序效果是否易于拼接、组装基因组则没有明确需求。于是,美国国家基因组研究院(NHGRI)提出了把全基因组测序降至1000美金的研究计划,从而引领科学界、企业界鼎力大举生长测序手艺。

  高通量测序的十年:

  2005年,454公司首先推出了二代测序仪;2006年,Solexa推出了Genome Analyzer,2007年年头Illumina收购了Solexa公司,在随后的几年陆续推出了Hiseq2000、MiSeq、Hiseq2500、MiseqDx、NextSeq 500测序仪,占有了高通量测序的大部门市场。ABI也在2007年推出的是SOLiD测序平台,随后收购了454测序仪发现者建立的Ion Torrent,转而鼎力大举推广PGM和Ion Proton平台。2014年,也就是高通量测序手艺生长的第十年,illumina公司的Hiseq X平台已经实现了1000美金一小我私家类基因组测序的目的。虽然这个价钱的实现,需要在保证未来数年富足机时的情形下才气完成,但也比十年前的30亿美金降低了300万倍。除此以外,另有很多多少公司开发了第三代测序仪,好比Pacific Biosciences的PacBio RS测序仪,DNA模板无需二代测序常用的PCR扩增的要领,就可以实现长读长、实时的测序;Oxford Nanopore MinION测序仪只有USB存储器那么大等等。

  2013年9月,illumina公司的MiseqDx平台,首次通过了美国FDA的手艺认证,作为开放平台和囊纤维化的试剂产物准许进入临床,标志着经由10年的生长,高通量测序手艺已从纯科学研究的平台进入临床诊断领域。

  各代测序的应用规模:

  一代测序(Sanger)适合单一片断,长度小于800bp的精准测序;二代适合快速、低价丈量海量数据,每次测序能发生数百、数万万条序列,但读长不凌驾500bp;而以PacBio为代表的三代测序更适合单分子测序,最长可以到几十K的读长,但测序质量略低。以是现在还没有哪一代测序手艺可以完全取代同类手艺,并不能简朴的通过名字来判断手艺先进性,主要的照旧各个平台都有各自最适合的应用领域。

  高通量测序应用规模:

  无需BAC文库构建就可以举行全基因组鸟枪法冲测序;数以万万计的序列同时测序;测序效果无需通过毛细管电泳获得等等特点决议了高通量测序仪具有辽阔的应用规模:基因组重新测序、基因组重测序、目的片断测序、数字化基因表达谱、小RNA测序、甲基化测序、卵白质DNA相互作用测序等等。本文主要就高通量测序的几个应用在临床诊断领域的开展做一个简朴先容。

  高通量测序的临床应用:

  1.染色体疾病检测

  2008年香港中文大学的卢煜明和斯坦福的Stephen Quake先后揭晓文章提出通过检测母体外周血中的游离DNA,可以准确的判断该孕妇胎儿的染色体非整倍体,该手艺无需通例的羊膜腔穿刺、绒毛膜穿刺等创伤性染色体疾病检测手艺,故常被简称为无创产前检测。

  无创染色体检测的手艺焦点为拷贝数变异的原理。测序所得的序列通过生物信息算法,把所有序列比对到人类参考基因组。通过计数每一个染色体的唯一对应的序列条数来获取全染色体拷贝数变异情形。若是其中有一个染色体增添一条或缺少一条,则该染色体的拷贝数会显著增添或淘汰。

  在当前常见的无创染色体非整倍体检测中,主要针对T21、T18、T13这三个染色体三体综合征。从海内外各家公司宣布的数字来看,准确率、阳性展望值都可以到达99%。相对血清唐氏筛查手艺,无创手艺大大提高了准确率,降低了假阳性率。从而推动产前检测手艺极大的生长,也资助高通量测序真正的进入了临床转化应用阶段。在染色体非整倍体疾病中,性染色体异常(XXX、XO、XXY)等也颇为常见,由于X染色体(155mb)相对Y染色体(60mb)要大许多,血浆游离DNA中母体的DNA含量占50~90%,从而造成无创检测性染色体异常 具有一定的难度,准确率基本在90%左右。

  除了染色体非整倍体以外,染色体病另有微缺失微重复,是指染色体上有局部片断缺失或泛起重复片断。常见的体现为染色体上的部门三体、部门单体,好比猫叫综合征、迪格奥尔格综合征(Digeorge) 、Wolf-Hirschhorn syndrome、Prader-Willi syndrome等等。自从高通量测序手艺应用于无创产前检测,业界也最先使用该手艺来检测微缺失微重复。由于微缺失微重复染色体改变相对较小,需要较深的测序深度,才气较准确的判断染色体变异情形。

  以上提到的都是无创的方式去检测染色体非整倍及微缺失微重复。对于诊断筛查成年人、婴幼儿、流产组织等染色体变异情形,使用高通量测序也是一种很好的选择,相对于传统的Array CGH,高通量测序手艺更准确、速率更快、检测分辨率更高,需要的起始样本量更低,只要几纳克。

  产前检测领域具有很大的特殊性,每一个效果都市影响一个还未出生的小生命,对于检测的准确率相对其他检测手艺要求要高许多。不管是假阴性照旧假阳性,都要求尽可能的低,否则会引起许多临床纠纷。而且由于要给后续的产前诊断手艺准确尽可能多的时间,以是就要求检测周期尽可能短。无创染色体检测需要每一个样本有一定的测序量,但并不是简朴的说测序越深效果就一定越好,需要保证每批测序的稳固性,就对实验室流程控制、试剂盒自己的质量控制、数据剖析的校正都提出了很高的要求。若是没有很好的控制,哪怕一台测序仪就跑一个样本,几十倍于通例的测序通量,也纷歧定就能准确判断效果阴阳性。

  2.基因突变检测

  差别于一代测序针对单一片断的测序检测基因突变,高通量测序往往可以针对一个基因多个位点、多个基因或全外显子突变的快速检测。在这类检测中,首先通过PCR或者探针捕捉的方式富集待检区域的DNA,然后通过高通量测序仪举行测序。高通量测序的准确率不如一代测序,以是为了获得准确的效果,每一个碱基位置都需要至少100条以上的序列效果。由于一个或多个基因位点组合、哪怕是全基因组外显子组合,也就70mb左右的DNA区域,现实事情中很容易实现100X以上的测序深度,往往都可以到达1000X以上。

  表皮生长因子受体(EGFR)基因突变检测为当前最常用的单基因突变检测,检测效果可用于辅助临床医生筛选可受益于易瑞沙、特罗凯和凯美纳等靶向药物的非小细胞肺癌患者。现在常用的要领为荧光定量手艺,需要做多个反映。凭据Ensembl的数据库,EGFR最长的编码形式有28个外显子,编码区共有9821个碱基,不管是一代测序照旧荧光定量都很难一次把EGFR所有位点都检测到。而针对10K的区域,对于高通量测序来说只需完成10mb测序量(1000X)就可以准确检测所有位点的信息。现在市场上主流的高通量测序仪一次测序都可以完成10G~1.8T,也就说可以一次开机至少可以完成1000个以上病人的样本。

  对于单基因的检测,除非这个基因很长,或者具有大片断的缺失、重复,否则用高通量测序来做单基因检测有点大材小用,现实临床磨练事情中要短时间聚齐1000个病人的样本也颇有难度,样本太少的话单个样本的平摊成本就会剧增。因此对于基因突变检测,高通量测序手艺更适合多基因组合、甚至全外显子捕捉等测序方式。

  3.微生物、病毒、细菌判定

  接纳PCR方式来判定微生物、病毒、细菌很是快捷、廉价,可是需要使用已知物种的DNA序列设计PCR引物探针,对于未知物种则一筹莫展;一代测序的要领是可以判定未知物种,可是样本要求是经由分散造就,DNA配景单一,混淆多个物种的DNA样本,一代测序会发生大量杂峰而无法正常得出测序效果。而高通量测序无需做任何造就、分散、也无需事先知晓物种,只要把待测样本的基因组DNA构建测序文库,测序发生数十万~数万万条差别的DNA序列,即可以容易知道待测样本中有何种微生物、病毒、细菌、每一个物种的比例、碱基是否有突变、是否为新物种。

  2009年H1N1病毒发作熏染时,有一名病人死于呼吸系统引起的多器官衰竭,然而并不知道详细的死因。科学家把病人的肺部穿刺组织的DNA拿来做高通量测序。最终在950万条序列中,含有0.85%的序列来自于H1N1病毒基因组,从而资助科学家发现了该病人的真正死因。在这样高人类基因组滋扰的配景下,现在其他手艺都难以快速发现致病病毒序列、以及分子分型。

  结核杆菌熏染现在越来越严重,由于结核杆菌生长缓慢,发现结核杆菌熏染及分子分型往往需要数月的时间。而结核杆菌的基因组只有4.4mb,使用高通量测序仪可以很是早期发现结核杆菌熏染,同时还可容易测得结核杆菌基因组的大部门区域,便于选择合适的敏感药物,以及确定是否为全新分子分型。

  肠道微生态为现在热门的研究领域,在肠道内微生物种类众多,各菌群的种类和比例会影响人体的建库、代谢情形。高通量测序仪也是该领域的唯一选择。

  4.肿瘤相关检测

  除了前述的肿瘤基因突变检测以外,在血浆中寻找肿瘤组织脱落的DNA片断,对早期发现肿瘤、监控术后复发等领域被寄予厚望。血浆中大部门为正常组织的脱落细胞DNA,若是有肿瘤发生,异常增生的细胞脱落外周血循环,降解成低品貌DNA片断,由于含量低、碎片化DNA,基因芯片和PCR都不能正常检测。在无创产前检测的手艺流程上做剖析优化,高通量测序手艺可准确检测游离DNA的每一个碱基,从而发现是否有肿瘤突变基因存在。美国霍普金斯大学也曾提出,首先对手术肿瘤组织举行全基因组深度测序,发现个体化的肿瘤基因组融合片断,随后在外周血中使用实时荧光PCR要领检测该个体化基因组融合片断的品貌,若是品貌提高则提醒肿瘤有转移、复发的可能。

  总结

  十年来,高通量测序逐步从实验室进入了临床磨练,展现了蓬勃的生气及想象空间,未来一定另有许多新的检测项目有待开发。10年来,高通量测序的单碱基成本已经降低了数百倍,也许在不久的未来,每一个新生儿都市有自己的基因组序列。海量数据的发生,也会反过来资助近几年遭遇瓶颈的药物研发机构,研发更多的个体化药物。

  高通量测序自己另有许多局限性,一次测序需要多个样本混淆、成本照旧相对昂贵、数据剖析具有挑战性、操作环节多。企业界、科学界都在解决测序仪的稳固性、样本处置惩罚的便捷性、一体化数据剖析等等问题。就像二代测序手艺无法取代一代测序一样,高通量测序手艺也无法取代PCR、FISH等其他类型的分子诊断手艺。高通量测序手艺会成为未来分子诊断领域的主要组成部门,大大推动手艺前进。

高通量测序的十年:从科研进入临床

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